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基因测序2——二代测序技术崛起之路

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avatar 发表于 2022-5-21 10:48:34 | 显示全部楼层 |阅读模式

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp,准确性高达99.999%,但其测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进,以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa,Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周。

  1、技术原理

  Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理如下图 abc所示。

  (1)DNA文库制备

  利用超声或者氮气喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同接头分A、B两种,即各44bp,由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp (TCAG)的“key”碱基构成,其中B接头的5’端带有生物素(Biotin)标记,用于磁珠纯化步骤。待测DNA进行 PCR扩增,并构建单链DNA文库(图1.a)。

  (2)emPCR(乳液PCR)

  454测序的一个关键步骤,将富集到的文库与直径约28um的测序磁珠、各反应物混合,加入特定的矿物油和表面活性剂,再利用振荡器剧烈振荡,使反应体系形成油包水(water-in-oil)的稳定乳浊液。在理想条件下,每一个液滴,或称微反应器中将只包含一个磁珠和一条单链DNA,通过控制该步骤的条件,1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后,每一个磁珠上将形成密集的DNA簇,这些DNA序列完全相同,即可用于后续的步骤。随后,乳液混合物被打破,扩增的片段依然结合在磁珠上。(图1.b)

  (3)焦磷酸测序

  454测序的反应板称为PTP,这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔,每个小孔仅能容纳一个磁珠,以便检测接下来的测序反应过程。

  测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板,每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对,则会在合成后释放焦磷酸基团,并发出荧光,每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同。同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录,通过光信号处理而获得最终的测序结果。

  图1. Roche 454测序系统原理[1]

  由于454测序技术中,每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行,因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长,当前454技术的平均读长可达400bp,并且其准确性仍能达到99%以上;但它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度,如当序列中存在类似于PolyA的情况时,测序反应会一次加入多个T,而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得,这就有可能导致结果不准确。

  2、代表厂家及仪器特点

  454 生命科学公司于2005年推出的GS20测序仪,是第一个商品化的NGS平台,具有里程碑式的意义。同年获得华尔街生物技术医药类的创新金奖。

  2007年,罗氏诊断(Roche Diagnostics)以1.55亿美元收购了454,并推出了一系列性能更优的NGS系统,极大的提升测序通量和准确性,也进一步增加了测序读长。虽然罗氏454具有读长优势,由于在454测序系统在通量、准确性、以及成本等方面缺乏竞争力,因此罗氏在2016年底终止了454 NGS测序相关的业务。


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